Periodoncia , Gingivitis, Dental implants, Periodontitis, Periodontist, Periodontics, Juan Jose Carraro, Bad breath, Bleeding gums, Fundacion carraro, Dr. Adolfo Aragonés, Dental hygiene, Gum surgery
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Proliferación de Fibroblastos Gingivales Humanos Tratados con Plasma Rico en Plaquetas in vitro
   

Adriana Paola Acosta Gómez. Odontóloga, Periodoncista, Pontificia Universidad Javeriana.
Centro de Investigaciones Odontológicas. Carrera 7 Nº 40-62 Edificio 26 Facultad Odontología. Bogotá, D.C., Colombia,

Octavio Alberto González Odontólogo, Pontificia Universidad Javeriana. Maestría en Microbiología Pontificia Universidad Javeriana Bogotá D.C., Colombia. Center for Oral Research Chandler Medical Center MN430 University of Kentucky, College of Dentistry Lexington, KY 40536

Ramón Pereira Ebratt. Odontólogo, Universidad de Cartagena, Periodoncista Universidad Nacional de Colombia. Centro de Investigaciones Odontológicas. Carrera 7 Nº 40-62 Edificio 26 Facultad Odontología. Bogotá, D.C., Colombia,

María Ximena Sánchez Arboleda Odontóloga, Universidad El Bosque, Periodoncista, Pontificia Universidad Javeriana.


RESUMEN
Teniendo en cuenta que la enfermedad periodontal constituye una patología de origen infeccioso, caracterizada por un patrón destructivo manifiesto en múltiples secuelas, en la actualidad ha surgido con gran impacto el concepto de estimulación y potencialización del proceso de cicatrización, por medio de la aplicación de factores de crecimiento polipeptídico, los cuales se encuentran en una fuente autóloga denominada Plasma Rico en Plaquetas (PRP). Este ha demostrado ser un agente altamente efectivo para estimular la proliferación celular, y por tratarse de una preparación autóloga, elimina la preocupación alusiva a la transmisión de enfermedades tales como HIV, Hepatitis B, C o D y otros patógenos de transferencia sanguínea, al igual que las reacciones inmunológicas asociadas con la colocación de materiales alogénicos y xenogénicos. OBJETIVO: Evaluar in vitro la proliferación celular de fibroblastos gingivales humanos expuestos a Plasma Rico en Plaquetas (PRP) en diferentes tiempos después de su obtención, para determinar si el tiempo desde el procesamiento hasta su aplicación, afecta la capacidad del PRP para inducir proliferación celular. MÉTODOS: En la presente investigación se obtuvieron cultivos de fibroblastos gingivales humanos entre 4° y 12° pase, los cuales fueron sometidos al estímulo con 1.0l de PRP 6, 24, 48, 72 y 96 horas después de procesado. La proliferación celular fue evaluada haciendo conteos en cámara de Neubauer con la técnica de exclusión de azul tripán, a las 48 horas después de su aplicación. Así mismo, se llevó a cabo una prueba de cuantificación de proteínas y número de plaquetas, con el fin de evaluar el comportamiento del PRP en los intervalos ya establecidos. RESULTADOS: La proliferación de FGH entre los grupos experimentales, con respecto al control no mostró diferencias significativas (p0.05) en ninguno de los tiempos de obtención del PRP evaluados; sin embargo, se observaron algunas tendencias de mejoría en la respuesta en tiempos tardíos de 72 a 96 horas.
PALABRAS CLAVE Plasma Rico en Plaquetas, Fibroblastos Gingivales, Proliferación Celular, Regeneración Periodontal, Ingeniería Tisular

INTRODUCCIÓN
La enfermedad periodontal ha sido definida como la inflamación que compromete todo el aparato de soporte del diente, y cuya extensión va desde la unidad dento-gingival, hasta la unidad dento-alveolar. Dicha enfermedad trae como consecuencias la pérdida de inserción del tejido conectivo y altura del hueso alveolar. Al ser considerada una patología de origen infeccioso(1) con un alto potencial destructivo, se han propuesto innumerables acercamientos biológicos con el fin de dar solución a las consecuencias acarreadas por la misma, dentro de los que la regeneración de los tejidos de soporte perdidos ha sido objeto de un gran número de investigaciones (2,3,4).

En la actualidad, ha surgido con gran impacto el concepto de estimulación y potencialización del proceso de cicatrización, por medio de la aplicación de factores de crecimiento polipeptídico (5), los cuales se encuentran en una fuente autóloga denominada plasma rico en plaquetas (PRP). Éste ha mostrado ser un agente altamente efectivo para estimular la proliferación celular, debido a su contenido rico en factores de crecimiento (PDGF (6,7), TGF- (8), FGF (9) e IGF (10,11), entre otros. Adicionalmente, siendo esta una preparación autóloga, elimina la preocupación alusiva a la transmisión de virus como el VIH, Hepatitis B, C o D y otros patógenos de transferencia sanguínea. De la misma forma, se disminuyen las reacciones inmunológicas, asociadas con la colocación de materiales alogénicos y xenogénicos (12,13).
El fibroblasto como célula predominante en número a nivel del periodonto, juega un papel clave durante los procesos de cicatrización y regeneración (13) mediante una respuesta proliferativa activa, entre otros fenómenos celulares y moleculares. La respuesta proliferativa del fibroblasto es inducida de manera efectiva por diferentes factores de crecimiento presentes en el plasma y en los gránulos plaquetarios, los cuales se hacen disponibles en condiciones normales entre 3 y 5 días de vida media de las plaquetas, al cabo del cual éstas se degranulan (14,15).
Aún no hay suficiente evidencia científica que sugiera el tiempo ideal del uso del PRP después de su obtención. Algunos autores han recomendado su utilización dentro de las primeras horas después de obtenido, basados en diversos estudios que confirman la efectividad de los factores de crecimiento en el plasma sobre los procesos de cicatrización y regeneración, dentro de los cuales el fibroblasto desempeña un rol fundamental. Sin embargo, las únicas investigaciones reportadas hasta el momento que hacen alusión a la aplicación del plasma dentro de las primeras horas, han sido realizadas por Lynch en 1991 (16), Rutherford en 1992 (17) y la última reportada por De Obarrio y colaboradores (18) en el año 2000.
Sin embargo, ninguna de estas afirmaciones presenta sustento científico en estudios anteriores relacionados con la cinética de proliferación celular. La disposición de los factores de crecimiento a partir de la degranulación plaquetaria y su influencia sobre la respuesta proliferativa del fibroblasto gingival humano (FGH) no se conoce, razón por la cual se planteó como objetivo evaluar in vitro la respuesta proliferativa de los FGH expuestos a PRP en diferentes tiempos después de su obtención.

MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención del Plasma Rico en Plaquetas

Con el fin de recolectar y procesar el plasma rico en plaquetas, se realizó el procedimiento en el banco de sangre del Hospital Militar Central, Bogotá, Colombia, siguiendo el protocolo establecido, de la siguiente manera: Se recogió sangre en una bolsa de colección triple, manteniéndola a temperatura ambiente (aproximadamente 20 –24°C). Luego, se separó el plasma rico en plaquetas de los hematíes, por procedimiento de centrifugación a 1800 rpm x 7minutos, dentro de las 6 primeras horas después de la extracción de la sangre. Posteriormente, se exprimió el plasma sobrenadante rico en plaquetas a la bolsa de transferencia prevista como bolsa de plaquetas y se refrigeraron los hematíes a 1 – 6° C. Se centrifugó el plasma rico en plaquetas, a una temperatura de 20°C, a alta velocidad (4000 rpm x 10 minutos) y se exprimió el plasma sobrenadante, pobre en plaquetas, hacia la segunda bolsa de transferencia sellando el tubo.
Inmediatamente, se procedió a la resuspensión de las plaquetas mediante un movimiento manual de agitación suave para permitir una resuspensión uniforme, sin agregación durante 2 horas.

Prueba de Proliferación
Cultivos de fibroblastos gingivales entre el 4° y 12° pase, previamente obtenidos en el Centro de Investigaciones Odontológicas (Facultad de Odontología, Universidad Javeriana), fueron utilizados para todas las pruebas. Se sembraron 2 x 104 células/ml en una placa de 24 pozos, las cuales crecieron en Medio Esencial Mínimo (MEM Sigma M0643) con Suero Fetal Bovino (SFB) al 10%, Penicilina 100U/ml y Estreptomicina 100 g/ml, durante 24 horas a 37C y 5% de CO2. Con el fin de sincronizar los cultivos en fase G0, estos fueron mantenidos en MEM solo, deprivado de SFB, por un periodo de 48 horas. Posteriormente, se procedió a estimular las células con 1.0l de PRP (pruebas previas con diferentes volúmenes de PRP no mostraron diferencias significativas ni en viabilidad celular, ni en respuesta proliferativa; los datos no se muestran), con una concentración de plaquetas de 540.000/ml, y fueron incubadas durante 48 horas a 37°C y 5% de CO2. Pasado este tiempo, se procedió a hacer el conteo celular con técnica de exclusión con azul tripán en cámara de Neubauer, previo desprendimiento celular con Tripsina 0.025% y EDTA 1mM durante 5 minutos a 37C, en una lectura única 48 horas después de incubación con PRP.

Cuantificación de Proteínas y Número de Plaquetas
Con el fin de evaluar el comportamiento del número de plaquetas y la cantidad de proteínas contenidas en el PRP con respecto al tiempo, se efectuó una prueba paralela al estudio de proliferación celular. La cantidad de proteínas fue evaluada con el reactivo de Bradford (Sigma B-6916, Lot88H5851), mediante espectrofotometría desde 6 hasta 96 horas después de procesado el mismo. Inicialmente se prepararon una serie de diluciones de albúmina sérica bovina, con el fin de obtener una curva de Absorbancia vs. Calibración. Posteriormente se evaluaron 50ml de PRP con 1.5ml de reactivo de Bradford para hacer la lectura a 580nm, en los diferentes intervalos de tiempo, hasta 96 horas. Simultáneamente se hicieron conteos de plaquetas en cámara de Neubauer, en los mismos intervalos de tiempo, con Oxalato de Amonio al 1% en una dilución 1: 3.

Análisis Estadístico
La presentación de cada uno de los aspectos involucrados en el estudio se hizo utilizando estadística descriptivas por medio del cálculo de frecuencias (absolutas y relativas), medidas de posición o de tendencia central (moda-mediana y media aritmética) y medidas de variabilidad o de dispersión (amplitud de variación, varianza, y desviación típica o estándar).
La posible asociación entre variables se analizó mediante el uso de la prueba de U de Mann Whitney, con una significancia estadística manejada de p0.05.

RESULTADOS
Proliferación celular con PRP
Los cultivos de FGH estimulados con PRP (1.0 ml) 6, 24, 48, 72 ó 96 horas después de obtenido, fueron evaluados bajo el microscopio de luz empleando la técnica de exclusión de azul tripán en cámara de Neubauer, en una observación efectuada 48 horas después del estímulo con PRP. Se observó un promedio de 52.000cél/ml para el grupo control (sin PRP), 40.000 cél/ml para aquellas estimuladas con PRP 6 horas después de obtenido, 36.000cél/ml para el estímulo con PRP 24 horas después de obtenido, seguido por 60.000cél/ml con el PRP de 48 y 96 horas después de obtenido y 56.000cél/ml para aquellas estimuladas con PRP 72 horas después de obtenido. El resultado del estímulo con PRP 24 horas después de obtenido, reveló menor número de células con respecto al grupo control (Figura 1), sin presentar diferencias estadísticamente significativas (p0.05).

Valoración de la Viabilidad celular en los diferentes tiempos de aplicación del PRP
Con respecto a la viabilidad celular se apreció un 60% para el grupo control (sin PRP), 63.3% en FGH con PRP 6 horas después de procesado, 93.3% en el de 24 horas después de procesado, 90% para el de 48 horas después de procesado, 86.7% en el de 72 horas después de procesado y 88.3% para el grupo de 96 horas después de procesado. Al respecto es posible evidenciar una aparente disminución en la viabilidad celular de FGH incubados con PRP de 6 horas, y un cambio notorio en el intervalo de tiempo entre las 6 y 24 horas, después de las cuales se observan datos estables en el número de células vivas (Figura 2).

Prueba de Cuantificación de Proteínas y número de plaquetas en PRP
Esta prueba se llevó a cabo con el fin de observar el comportamiento del PRP en el tiempo, con respecto a la concentración de proteínas y recuento plaquetario, obteniendo los siguientes resultados: Para la prueba efectuada en el grupo de 6 horas se encontró una concentración de proteínas de 3.5 mg/ml, en presencia de 480.000 plaquetas/mm3; para las 24 horas la concentración fue de 3.0 mg/ml con 450.000 plaquetas/mm3; en el grupo de 48 horas se observó una concentración protéica de 3.5 mg/ml y 495.000 plaquetas/mm3; en el de 72 horas 3.5mg/ml con 444..000 plaquetas/mm3; y finalmente para el grupo de PRP de 96 horas 3.5mg/ml con 450.000 plaquetas/mm3 (Figuras 3 y 4).

AGRADECIMIENTOS
CENTRO DE INVESTIGACIONES ODONTOLÓGICAS por el apoyo brindado a través de la infraestructura que hizo posible la realización de este trabajo de investigación.
HOSPITAL MILITAR CENTRAL Bogotá D.C. Banco de Sangre por su colaboración en la obtención y procesamiento del Plasma Rico en Plaquetas
DRA. CLAUDIA VALDIVIESO por su gran aporte en la realización del recuento plaquetario.

DISCUSIÓN
Durante los últimos años la utilización de la fuente autóloga de factores de crecimiento, conocida como PRP ha tenido gran acogida en el campo investigativo, despertando gran interés con respecto a los mecanismos involucrados en su funcionamiento y el efecto que éstos ejercen a nivel celular. Al respecto, se han realizado diversos estudios que confirman la efectividad de dichos factores sobre los procesos de cicatrización y regeneración, dentro de los cuales el fibroblasto juega un papel fundamental. Aunque se sabe que la vida media de las plaquetas es de 3 a 5 días (14,15), solamente unas pocas investigaciones in vivo hacen alusión a la necesidad de aplicar el plasma dentro de las primeras 24 horas (Lynch 1991 (16), Rutherford 1992 (17) y De Obarrio y colaboradores 2000(18).

Puesto que estas afirmaciones no presentan sustento científico en estudios anteriores relacionados con la cinética de proliferación celular, en la presente investigación se obtuvieron cultivos de fibroblastos gingivales humanos entre 4° y 12° pase, los cuales fueron sometidos al estímulo con PRP con 6, 24, 48, 72 y 96 horas después de procesado, con el fin de evaluar su proliferación comparada con un grupo control (sin PRP) en una observación hasta 48 horas después de su aplicación.

Con respecto a los resultados obtenidos, se encontró que el PRP hasta las 96 horas después de obtenido no alteró significativamente la proliferación celular de FGH. Probablemente periodos de tiempo mayores puedan mostrar alguna diferencia significativa, teniendo en cuenta que la tasa de generación de fibroblastos muestra un crecimiento logarítmico hasta las 96 horas. Sin embargo, aunque no hubo diferencias significativas con respecto a la proliferación celular, se encontraron tendencias importantes a resaltar. Cultivos incubados con PRP obtenido después de las 6 horas mostraron una disminución en el número de células, acompañada por una disminución en la viabilidad celular. Paralelamente, se observó una concentración de proteínas de 3.5 mg/ml, las cuales son posiblemente de origen plasmático (albúmina, factor tisular, Proteína C, Proteína S, inhibidor C1, -2 macroglobulina entre otras) (15), pues el tiempo de degranulación plasmática es de 3 a 5 días (14,15). Adicionalmente, en esta fuente también se encuentran una serie de factores de crecimiento. Es posible, que esta cantidad de factores y proteínas encontrada en el plasma esté generando una sobrecarga para los FGH en los periodos iniciales, lo cual probablemente se encuentre asociado con la disminución en el número de células y disminución en la viabilidad celular. Por otra parte, se ha sugerido que grandes concentraciones de los factores de crecimiento contenidos dentro del plasma, como son el TGF-, PDGF-BB y el IGF-II, podrían inducir una muerte celular programada (19,20,21). Estos trabajos sugieren que al TGF- (20), PDGF-BB (19) y el IGF-II (21) como reguladores de apoptosis en diferentes tipos celulares, incluyendo los fibroblastos. Frente a esta observación, se sugiere para estudios futuros la utilización de marcadores de apoptosis con el fin de evaluar el mecanismo biológico por el cual se lleva a cabo la disminución en el número de células observado ante la aplicación de PRP durante las primeras horas después de procesado.

Los cultivos incubados con PRP después de 24 horas de obtenido, mostraron una disminución en el número de células, una viabilidad celular estable y una menor concentración de proteínas (3.0mg/ml), las cuales también posiblemente sean de origen plásmatico. Dicha disminución, probablemente se deba a una denaturación de las proteínas plásmaticas, ocasionada por alteraciones ambientales mínimas, especialmente frente a la temperatura (22). Así mismo, fenómenos como la disminución en el número de células y la estabilidad de la viabilidad celular, pueden ser explicados por medio de la presencia de factores de crecimiento, como el TGF-. Según Graves y colaboradores, este factor ejerce un efecto sobre las células de origen mesenquimal, ubicándolas en la fase G1 del ciclo celular, induciendo un posible bloqueo en los mecanismos de división y multiplicación celular (23).

El número de FGH incubados con PRP obtenido después de 48, 72 y 96 horas no mostró cambios significativos, aunque hay una tendencia a incrementar. En los mismos intervalos de tiempo de obtención, se mantuvo la viabilidad celular con un aumento en la concentración de proteínas. Es probable que el aumento protéico evidenciado ocurriera como consecuencia de la liberación de factores de crecimiento a partir de los gránulos-, generando un nivel de estabilidad en el tiempo, correspondiente a la vida media de las plaquetas. Dicho fenómeno coincide con la liberación de factores de crecimiento a partir de las plaquetas, la cual promueve la multiplicación celular, sin inferir con la viabilidad de las mismas. Teniendo en cuenta esto, se sugiere que lo ocurrido en el proceso anteriormente mencionado podría estar asociado a un equilibrio biológico adaptativo, el cual es dependiente de una interacción entre la degranulación de las plaquetas con el colágeno sintetizado por los FGH, mediante procesos de señalización dados por los receptores en la superficie plaquetaria(15,24).

La viabilidad celular del grupo control (60%), el cual comparativamente con el resto de los grupos revela un número importante de muerte celular, podría estar asociada con la deprivación de SFB durante la sincronización en G0. Esto encuentra asociación con lo presentado por Wang y colaboradores (1999) quienes efectuaron una investigación, induciendo muerte celular programada por medio de la deprivación de SFB (25). Sin embargo, es preciso resaltar que según los resultados arrojados por el presente estudio, los valores obtenidos de la proliferación celular no revelan diferencias estadísticamente significativas con respecto al grupo control (p0.05).

En síntesis, se puede establecer que todos aquellos estudios que han utilizado el PRP en investigaciones in vivo, sugieren su uso dentro de las primeras 24 horas. Sin embargo, no existe literatura que soporte biológicamente dicho fenómeno clínico. Bajo las limitaciones del presente estudio, desde el punto de vista biológico, se sugiere una respuesta celular aceptable y un equilibrio biológico, a partir de las 48 horas después de obtenido el plasma, donde el efecto primordial surge a partir de la actividad plaquetaria.
Con el fin de profundizar en los conceptos planteados por esta investigación se sugiere efectuar una prueba de viabilidad plaquetaria, con el objeto de establecer su función posterior a la secreción del contenido granular, así como la evaluación de la producción de matriz colágena a partir de los FGH dentro de las primeras 24 horas, con el fin de determinar la posible existencia de otros mecanismos llevados a cabo dentro de este periodo de tiempo, diferentes a la proliferación celular.

BIBLIOGRAFIA GENERAL
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